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小科普 | Simple Western 的横空出世
[ 发布日期:2025-1-17 16:53:27    阅读次数:288 ]

WB 的发展历程
长期以来,检测和分析蛋白质的能力一直是科学家们的关键追求。几十年来,对蛋白质检测准确性和可靠性的追求促进了一系列技术飞跃。从早期的凝胶电泳和 Western blotting 的发明到自动化 Western 分析的发展,研究人员不断突破蛋白质分析工具的界限。
1807年,科学家首次观察到在电场作用下,水中的粘土颗粒向正极移动的现象,这一现象为电泳奠定了基础。直到20世纪50年代,随着淀粉和聚丙烯酰胺等电泳基质的引入,研究人员才开始使用凝胶电泳技术从复杂的混合物中分离蛋白质1。然而,这些早期的电泳方法无法区分大小相似的蛋白质。1970年,在医学研究委员会分子生物学实验室研究噬菌体T4的分子生物学家乌尔里希·莱姆利(Ulrich Laemmli)意识到,一种名为十二烷基硫酸钠(SDS)的蛋白质变性洗涤剂可以帮助根据分子量将多肽链分离出来,因为它们在凝胶中迁移时会发生这种变化。通过创建一种含有不同浓度SDS和聚丙烯酰胺的不连续双层凝胶系统,莱姆利能够更清楚地观察到蛋白质条带。这种方法现在被称为SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE),它使他能够识别出构成噬菌体T4衣壳的先前未知的蛋白质2。与此同时,其他研究人员正在使用凝胶电泳来分离 DNA 等生物分子。1975 年,爱丁堡大学的分子生物学家埃德温·索恩(Edwin Southern)通过从电泳分离的片段中检测特定 DNA 序列,将这项技术向前推进了一步。为了实现这一目标,他引入了一个新步骤:印迹。在琼脂糖凝胶上分离 DNA 片段后,他将它们转移到硝酸纤维素膜上,从而捕获 DNA3。然后,他使用可以与特定 DNA 序列结合的放射性 RNA 探针,并通过放射自显影法检测它们。索恩以自己的名字将这项发明命名为 Southern blotting。
随着Southern blotting成为分析DNA样本的流行工具,它也激发了研究人员探索其在其他应用中的潜力。1977年,斯坦福大学的生化学家乔治·斯塔克(George Stark)和他的同事们通过使用一种名为重氮苄氧甲基(DBM)纸的化学改性纤维素作为转移RNA分子的介质,引入了一种RNA印迹法4。他们将这种创新命名为“Northern blotting”,以反映其与Southern blot的联系。在成功之后,斯塔克的团队进一步将印迹法应用于蛋白质分析,并于1979年7月发表了他们的方法。他们对莱姆利的不连续凝胶系统进行了修改,通过将聚丙烯酰胺/琼脂糖凝胶混合物加入细胞裂解液中来分离蛋白质。用于蛋白质转移时,他们使用了DBM纸,并使用放射性蛋白质来探测靶蛋白。使用该方法,该小组成功地鉴定了感染猴痘病毒的肿瘤抗原5
与此同时,世界另一端的两位生物化学家,弗里德里希·米歇尔研究所的哈里·托宾 (Harry Towbin) 和弗雷德·哈奇癌症中心的尼尔·伯内特 (Neal Burnette) 正在独立开发一种类似的蛋白质印迹方法。两个团队都建立了一种电泳印迹程序来转移蛋白质,其中包括使用电场将蛋白质从电泳凝胶驱动到硝酸纤维素膜上。哈里·托宾利用一抗结合靶蛋白,然后使用放射性或荧光标记的二抗检测一抗。尼尔·伯内特的蛋白质检测方法略有不同——他使用了一抗和二抗放射性标记蛋白。哈里·托宾在1979年发表了他的方法,比斯塔克的论文发表晚了两个月,而伯内特的手稿是在同一时期准备的,但最初被拒绝。1981年,伯内特的论文被同一本杂志接受,他将这种方法称为 Western blotting6.
蛋白质印迹很快引起了全世界研究人员的注意。在它诞生后的头十年里,它成为了检测与疾病相关的蛋白质的关键诊断工具。一些研究人员将WB应用于血液样本中HIV抗体的识别7,而另一些人则用它来检测由错误折叠的朊蛋白引起的克雅氏病8。在此期间,技术进步使 Western 印迹更容易获得。研究人员引入了新的膜材料,例如聚偏二氟乙烯和尼龙,以改进印迹过程。这些材料耐用、稳定,可以更有效地结合蛋白质。检测方法也发生了变化。化学发光法(使用与酶联次级抗体反应后发出光的化学发光底物)取代放射性方法,成为更受欢迎的用于观察蛋白质条带的方法。
Simple Western 的横空出世
尽管有这些改进,但对于进行 Western blotting实验的研究人员来说,该技术也有一定的局限性。Western blot方法的实验步骤较多,操作较为复杂且耗时较长,并且该技术对实验条件要求较高,如电泳分离不充分、转印不完全、封闭不足或抗体特异性差等都会影响最终的结果。此外,该技术无法完成对蛋白质的绝对定量,对于低丰度蛋白也很难很难检测到清晰准确的条带。且传统 Western blot的低通量性难以满足大规模筛选、组学研究等对多样本、多蛋白同时分析的需求。
为了解决传统 Western blot的局限性,2011 年,ProteinSimple 团队在人类蛋白质组组织年度世界大会上推出了第一台基于毛细管的自动化 Simple Western 仪器 Simon™ 系统。相对于传统的蛋白质印迹来说,Simon™显著提高了蛋白质分析的准确性和可重复性。2014 年,ProteinSimple (于2014年被Bio-Techne收购)推出了 Wes™ 系统,它可在 3 小时内处理多达 25 个样品,灵敏度是 Simon™的 10 倍。
为了满足客户的需求,Bio-Techne在2018年推出了 Jess™ 系统,它具有化学发光和荧光双重检测功能,使用户能够检测样品中的更多靶标。并且 Jess™ 系统还集成了内置的总蛋白测量功能,以便更轻松地进行数据标准化。此外,Bio-Techne还开发了一种创新的 RePlex™ 检测试剂盒,该检测试剂盒模拟了传统蛋白质印迹中的剥离和重新检测步骤,但在同一毛细管内,使研究人员能够从每个样品中提取更多数据。Simon™、Wes™ 和 Jess™ 的成功只会推动 Bio-Techne进行更多创新。
此后,Bio-Techne一直致力于扩展 Simple Western 的能力,以更好地支持不同的研究需求。例如,2021年推出的 Abby™ 系统为寻求自动化 Western 印迹工作流程的研究人员提供了一种易于访问、经济实惠的解决方案。
2024年,Bio-Techne隆重推出 Simple Western 家族的最新成员:Leo™系统。Leo™ 一次运行可处理多达 100 个样品,并仅需 3 小时即可提供结果,显著提高了通量,使其成为药物筛选和生物标志物发现等大规模研究的理想选择。其扩展的多重检测功能允许每个样品检测多达 8 个蛋白质靶标,为研究人员提供来自单个实验的更全面的数据。这些功能使 Leo™ 成为支持各种研究领域和药物开发阶段的多功能工具。
 

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参考文献
1. Sule, R., Rivera, G. & Gomes, A. V. Western Blotting (immunoblotting): History, Theory, Uses, Protocol and Problems. BioTechniques 75, 99–114 (2023).
2. Laemmli, U. K. Cleavage of Structural Proteins during the Assembly of the Head of Bacteriophage T4. Nature 227, 680–685 (1970).
3. Southern, E. M. Detection of specific sequences among DNA fragments separated by gel electrophoresis. J. Mol. Biol. 98, 503–517 (1975).
4. Alwine, J. C., Kemp, D. J. & Stark, G. R. Method for detection of specific RNAs in agarose gels by transfer to diazobenzyloxymethyl-paper and hybridization with DNA probes. Proc. Natl. Acad. Sci. 74, 5350–5354 (1977).
5. Renart, J., Reiser, J. & Stark, G. R. Transfer of proteins from gels to diazobenzyloxymethyl-paper and detection with antisera: a method for studying antibody specificity and antigen structure. Proc. Natl. Acad. Sci. 76, 3116–3120 (1979).
6. Burnette, W. N. “Western Blotting”: Electrophoretic transfer of proteins from sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gels to unmodified nitrocellulose and radiographic detection with antibody and radioiodinated protein A. Anal. Biochem. 112, 195–203 (1981).
7. Esteban, JuanI. et al. IMPORTANCE OF WESTERN BLOT ANALYSIS IN PREDICTING INFECTIVITY OF ANTI-HTLV-III/LAV POSITIVE BLOOD. The Lancet 326, 1083–1086 (1985).
8. Brown, P. et al. Diagnosis of Creutzfeldt-Jakob Disease by Western Blot Identification of Marker Protein in Human Brain Tissue. N. Engl. J. Med. 314, 547–551 (1986).
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