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什么是通用型iPSCs？

通用型诱导多能干细胞（iPSCs）是指经过基因编辑处理，能够降低免疫原性、避免免疫识别与攻击，从而可适用于异体移植的诱导多能干细胞。此类细胞在异体移植场景中不会引发免疫排斥反应，具有“现成”可用、经济高效的特点，能够为大规模临床应用提供适合的细胞来源，推动再生医学及基因治疗技术的发展。

人类白细胞抗原（HLA）是细胞表面的关键分子，免疫系统通过其来区分自身和非自身细胞。在异体移植中，供体与受者的HLA不匹配会引发免疫排斥反应。通用型iPSCs的构建需要对HLA分子进行基因编辑，以减少或消除HLA的表达，从而避免免疫系统的识别与攻击。然而，HLA分子分为I类和II类，占据基因组的较大区域，难以通过单一基因编辑策略完全删除。研究发现，敲除β₂微球蛋白（β₂M）亚基可以有效抑制HLA-I类分子的表达²，而敲除CIITA转录因子能够抑制HLA-II类分子的表达³。通过联合敲除这两种基因，可以实现iPSCs中HLA分子的全面抑制。

然而，HLA-I类分子的缺失会导致自然杀伤（NK）细胞的攻击性显著增强，因为NK细胞通过识别HLA-I类分子上的特定配体来判断细胞是否正常。为了逃逸NK细胞的攻击，部分研究尝试仅保留HLA-C、HLA-E、HLA-F和HLA-G等亚类分子^4,5，但这样的iPSCs仍然无法完全避免免疫排斥反应，仅能视为“半通用”细胞。因此，构建完全通用型iPSCs的关键挑战在于有效地防止NK细胞的攻击¹。

近期的研究进展表明，通过抑制NK细胞激活受体（KAR）的配体表达，例如敲除CD155基因并保留HLA-E分子，可以使iPSCs在逃逸NK细胞识别的同时，仍然保留对肿瘤细胞的抑制能力⁶。然而，NK细胞通过多种KAR与不同的配体结合，且配体表达水平会因细胞类型而异，这增加了通用型iPSCs构建的复杂性。

蛋白表达筛选验证基因敲除或敲低的蛋白编码序列

流式细胞术和ELISA在检测细胞内蛋白时存在局限性，传统Western Blot耗时且重复性差。相比之下，Simple Western技术的Jess平台能高效检测膜结合蛋白及细胞内靶标蛋白，仅需3 µL iPSCs裂解液即可实现可重复定量分析，并可用于筛选残留Cas9蛋白，保障工程化iPSCs的安全性。

SW 筛选iPSCs中的HLA以及KAR配体敲除

利用CRISPR-Cas9基因编辑技术创建了靶向 HLA和KAR配体的基因敲除文库（表1）。

表 1 iPSCs 中的基因敲低靶标。β₂M和CIITA敲除分别抑制HLA-1和HLA-2；BAT3、CD155和MICA为已知KAR配体。CIITA和BAT3为胞内定位，其余为表面暴露靶点。

利用SW检测筛选文库中的β₂M和CIITA低表达的克隆（分别抑制HLA-1和HLA-2）（图1左）。使用RePlex™模块通过NIR荧光通道在第二轮检测总蛋白（图1右）。类似方法用于筛选KAR配体表达（图2）。

图 1 Simple Western 筛选 iPSCs 中的 HLA 敲除。RePlex™ 模块用于在探针 1（左）中同时检测 β2M 和 CIITA，在探针 2（右）中通过 NIR 检测总蛋白

图 2 Simple Western 筛选KAR配体敲除iPSCs克隆。RePlex™ 模块用于在探针 1（左）中同时检测 BAT3、CD155 和 MICA，在探针 2（右）中通过化学发光检测总蛋白。

图3显示的是以野生型为对照，量化各克隆的敲低百分比，并将流式与Simple Western 进行对比。

图 3 通过流式及Simple Western敲低靶蛋白的数据对比。数值表示相对于野生型对照的百分比表达量（野生型表达量为100%，完全敲低为0%）。靶点CIITA和BAT3未在流式细胞术数据中展示，可能是由于它们的细胞内定位导致流式检测结果不可靠。CIITA和BAT3的敲低百分比量化数据改在表4中呈现。

Simple Western显示多数克隆的靶点敲低率高于流式（图3，表2）。克隆#7对5个靶点的敲低效果最佳（除BAT3为69%外，其余均低于野生型50%）。

表 2 Knockdown of intracellular targets that were unreliably detected by flow cytometry were measured by the Simple Western platform. 数值表示相对于野生型对照的百分比表达量（野生型表达量设为100%，完全敲低为0%）

残留Cas9筛选

CRISPR-Cas9工程化iPSCs需监测残留Cas9，Simple Western检测显示所有克隆的Cas9均低于6.4 ng/mL重组对照（图4）

图 4 Simple Western 筛选工程 iPSCs 中的残留 Cas9

经基因改造成为通用低免疫原性供体的iPSCs需在蛋白质水平进行功能验证。在此环节中，Simple Western技术相比于传统蛋白质分析方法，在以下几个方面展现出它的优势：

Simple Western仪器可无差别检测全细胞裂解液、表面蛋白及纯化蛋白，全程仅需3小时且无需人工操作。

传统Western blot方法可轻松转移至Simple Western平台。作为毛细管电泳免疫分析，其提供尺寸特异性及抗体靶向检测，已验证抗体超5,000种。

Simple Western检测仅需3 μL微量样本, 无需延长细胞培养。

Simple Western具有高重复性、高灵敏度及定量分析功能。作为开放式毛细管Western blot技术平台，Simple Western用户可自由选用任何商业化或定制抗体，实现对目标蛋白及其异构体的特异性检测。

参考文献

1. Koga K, Wang B, Kaneko S. Current status and future perspectives of HLA-edited induced pluripotent stem cells. Inflamm Regen. 2020 Oct 1;40:23.

2. Riolobos L, Hirata RK, Turtle CJ, Wang PR, Gornalusse GG, Zavajlevski M, Riddell SR, Russell DW. HLA engineering of human pluripotent stem cells. Mol Ther. 2013;21(6):1232–1241.

3. DeSandro A, Nagarajan UM, Boss JM. The bare lymphocyte syndrome: molecular clues to the transcriptional regulation of major histocompatibility complex class II genes. Am J Hum Genet. 1999;65(2):279–286.

4. Xu H, Wang B, Ono M, Kagita A, Fujii K, Sasakawa N, Ueda T, Gee P, Nishikawa M, Nomura M, Kitaoka F, Takahashi T, Okita K, Yoshida Y, Kaneko S, Hotta A. Targeted Disruption of HLA Genes via CRISPR-Cas9 Generates iPSCs with Enhanced Immune Compatibility. Cell Stem Cell. 2019 Apr 4;24(4):566-578.e7.

5. Kitano Y, Nishimura S, Kato TM, Ueda A, Takigawa K, Umekage M, Nomura M, Kawakami A, Ogawa H, Xu H, Hotta A, Takasu N, Tsukahara M. Generation of hypoimmunogenic induced pluripotent stem cells by CRISPR-Cas9 system and detailed evaluation for clinical application. Mol Ther Methods Clin Dev. 2022 May 29;26:15-25.

6. Wang B, Iriguchi S, Waseda M, Ueda N, Ueda T, Xu H, Minagawa A, Ishikawa A, Yano H, Ishi T, Ito R, Goto M, Takahashi R, Uemura Y, Hotta A, Kaneko S. Generation of hypoimmunogenic T cells from genetically engineered allogeneic human induced pluripotent stem cells. Nat Biomed Eng. 2021 May;5(5):429-440.