外泌体（Exosomes）是由内体衍生的小型脂质纳米颗粒，直径约 30-200 纳米，大多数活细胞会通过胞吐作用主动分泌外泌体^⁠[1]。无论是在病理还是生理状态下，外泌体的释放既可以是持续性的，也可以是诱导性的，且释放过程具有动态性、可控性和功能相关性。外泌体的分子组成与释放量取决于其来源细胞的状态。外泌体可从多种细胞系、原代培养物中分离获得，也可从血清、血浆、唾液等生物体液中提取。鉴于来源的多样性，外泌体具有多效的生理功能，且越来越多的研究表明，其在癌症、感染性疾病、神经退行性疾病等多种病理状态中发挥着重要作用。因此，外泌体成为液体活检方法中的关键研究对象^⁠[2]。此外，外泌体还可通过工程改造，成为极具潜力的药物递送载体^⁠[3]。

由于外泌体体积微小，从复杂的生物基质中分离外泌体颇具挑战性，且分离产量通常较低。在此背景下，Simple Western™成为研究外泌体的理想技术：该方法仅需 3 微升样品，且具备皮克级灵敏度，大幅减少了传统Western blot对所需外泌体量的要求。随后，可使用针对外泌体相关抗原的特异性检测抗体对之进行表征分析 —— 这些目标抗原既可以是外泌体的通用标志物，也可以是其来源细胞或体液所特有的标志物。本实验方案中，我们将利用市售的外泌体标准品和抗体，通过Simple Western™检测外泌体的通用标志物和来源特异性标志物。

Flotillin-1：作为经典通用标志物，在三种标准品中均检测到（图1A）。

Alix：在三种标准品中均有表达，但A549细胞来源外泌体中表达量更高（图1D）。

Annexin V：作为凋亡标志物与血液抗凝蛋白，在A549细胞、血浆来源外泌体中检测到，在血清来源外泌体中未检测到（图1B）。

EGFR（HER1）：仅在A549细胞来源外泌体中检测到，血清、血浆来源外泌体中无信号（图1C）。

图 1 利用Simple Western™测外泌体目标抗原。A：flotillin-1；B：Annexin V；C：EGFR；D：Alix。

CD63：仅当用PNGase F（去糖基化酶）处理外泌体标准品后，才可检测到信号，提示糖基化修饰对该标志物检测的影响（图2）。

表2中其余抗体（如Annexin A2、HSPA8/HSC70、TSG101等）均通过Simple Western验证，可在对应外泌体标准品中检测到目标信号（图2）。

图2. 在血浆和 A549 细胞来源的外泌体标准品中，各目标抗原的检测泳道视图。

Simple Western技术核心价值

仅需3-5μL外泌体裂解液（传统WB需50μL+），适配珍贵样本；毛细管全流程减少样本损耗，适合低丰度膜蛋白。  

皮克级检测下限，可测CD63/Alix等，经PNGase F处理破解糖基化干扰，实现EGFR等特异性检测。  

12-230kDa毛细管电泳去杂，外泌体裂解后可直接上机，无需繁琐纯化。  

单样本同步测8个靶点，符合MISEV标准，动态范围覆盖6个数量级。  

3小时全自动化出结果，减少蛋白降解；每孔独立质控，满足外泌体制备QC。

支持绝对/相对定量，低样本量+高重复性，适配液体活检标志物开发，加速科研到临床转化。