图 S7. 利用差示扫描荧光法（DSF）评估蛋白质变体的热稳定性。（A-D）分别为野生型 SOX、CBM3-XP-SOX、SOX-EAAK-CBM3 和 CBM3-XG-SOX 的DSF热稳定性曲线。

总体而言，通过分子动力学模拟、SDS-PAGE 和差示扫描量热法（DSF）分析，初步将 CBM3 融合到 SOX N 端时连接区的不稳定性归因于 XP 刚性连接子基序，其韧性不足使其在生理压力下易于断裂。相比之下，C 端融合连接子采用了包含 EAAK 基序的α-螺旋构象——这一结构特征在保持固有刚性的同时增强了连接子的韧性。这一综合分析表明，连接子的拓扑结构和二级结构对 CBM3-SOX 融合体的功能稳定性有显著影响，含 EAAK 的α-螺旋连接子提供了最佳的机械耐受性以维持结构域的连接（图 4F2、G2）。

本研究通过合理的基因设计和生物信息学指导优化，系统地构建了 CBM3 融合 SOX 变体，以开发用于肌酐检测的高性能生物传感元件。通过研究融合位点、连接子拓扑结构和结构稳定性对酶活性、固定化效率和电化学性能的影响，我们建立了一个稳健的框架，用于工程化融合酶以适应生物传感器应用。

CBM3 融合 SOXs 的稳定性测定

为评估融合了 CBM3 的 SOXs 的结构稳定性，将酶溶液稀释至最终浓度为 1 毫克/毫升，置于 PBS 缓冲液（pH 值 8.0）中，在室温下孵育 7 天。每天定时取样，随后进行 SDS-PAGE 分析。

使用北京佰司特科技有限责任公司生产的PSA-16 型仪器对目标蛋白的热稳定性进行了评估。首先将样品稀释至 1 毫克/毫升的浓度。然后，将 20 微升稀释后的样品置于石英玻璃管（产品编号162301CP，同样由北京佰司特科技有限责任公司生产）中。采用线性温度扫描法，测量 330nm和 350nm处的内源性蛋白质荧光强度。温度范围为 30 至 90 摄氏度，升温速率为 1 摄氏度/分钟。根据 F350/F330 曲线的斜率计算热变性中点温度（Tm）。每个样品均进行了 3 次测量。 

差示扫描荧光法(differential scanning fluorimetry, DSF)是一种方便快捷的高通量药物筛选及靶标发现的方法，通过荧光染料或蛋白内源荧光信号检测升温过程中蛋白构象的变化计算其熔解温度Tm（melting temperature，Tm，也称为热变性温度）。蛋白中的色氨酸和酪氨酸可以被280 nm的紫外光激发并释放出荧光，其荧光性质与所处的微环境密切相关。蛋白变性过程中，色氨酸从疏水的蛋白内部逐渐暴露到溶剂中，荧光释放的峰值也从330 nm逐渐转移到350 nm。该方法具有蛋白样品消耗量少、通量高、温度变化范围广及数据准确等优点，被广泛用于蛋白质稳定性（蛋白质热稳定性参数及其影响因素）、蛋白结构和构象、蛋白-配体相互作用及蛋白质稳定剂、抑制剂、辅助因子等领域的研究。

内源差式扫描荧光inDSF，基于蛋白质中特定氨基酸的荧光特性。这些氨基酸的荧光强度与其所处的微环境密切相关，因此，当蛋白质的结构发生变化时，这些氨基酸的荧光信号也会随之改变。不需要额外的荧光染料加入到检测体系中，利用蛋白内部芳香族氨基酸的自发光原理。不需要任何额外的标记或固定步骤，避免引入结果的不确定性。

北京佰司特科技有限责任公司于2023年10月01日，推出了自主研发的第一款国产的基于内源差示扫描荧光技术（intrinsic fluorescence DSF）的蛋白稳定性分析仪（PSA-16），该设备性能和参数达到进口设备的水平，价格却远低于进口产品，弥补了目前国产自主设备在蛋白稳定性专业研究分析领域的空白。并于当年年底就成功安装了第一台设备到中牧股份兰州生物药厂。随后在2024-2025年又连续成功安装了多台到工业企业和科研单位，包括：上海近岸科技有限公司、郑州大学河南省医药科学研究院、吉林大学、辽宁大学、成都生物制品研究所有限责任公司、北京工商大学、石河子大学、北京友谊医院消化健康全国重点实验室、深圳技术大学、中国科学院深圳先进技术研究院、蓝星安迪苏南京有限公司、清华大学、成都中医药大学等，并获客户良好反馈。

北京佰司特科技有限责任公司积极服务客户，助力武汉大学、河南大学、齐鲁工业大学（山东省科学院）、中科院武汉病毒所、中国农业大学等单位合作发表多篇高质量论文（Nature子刊《npj Vaccines》、《International Journal of Biological Macromolecules》、《ACS Nano》、《Nucleic Acids Research》《Acta Crystallographica》等）。