本研究以HepG2细胞为研究模型，探讨了食品包装中常见的污染物邻苯二甲酸二丁酯(DBP)对肝功能的影响。采用类器官和器官芯片三维（3D）培养技术构建肝脏模拟模型，随后将其暴露于DBP环境。研究结果表明，在HepG2 3D细胞模型中，暴露于DBP会诱导氧化应激反应，破坏细胞氧化还原平衡，并显著增加活性氧（ROS）的水平。过量的ROS可损伤细胞内的生物大分子，导致脂质代谢紊乱。具体来说，ROS介导的脂质过氧化改变细胞膜的物理和化学性质，而DBP同时干扰关键酶的活性。这两种因素的协同作用导致脂质合成和降解失衡，最终损害肝功能。此外，本研究采用多种技术方法，包括代谢组学分析、生化指标检测和免疫荧光染色，系统地研究了DBP诱导的肝损伤的分子机制，从而为预防与食品包装污染物相关的肝病提供了重要的理论基础。
方法：
科学假说：DBP诱发肝功能障碍的机制
3DHepG2细胞平台的制备（A）肝类器官的构建；（B）肝脏器官芯片的构建
（A）所示，本研究选择培养至第六代的2D HepG2细胞。细胞计数后，进行21天的细胞培养密度优化。如图S1所示，通过初步实验建立了各种细胞接种密度梯度。将每孔含有100、200、400、600、1000和2000个细胞的细胞悬浮液接种到96孔U底超低附着培养板中。接种后，将完全培养基添加到每个孔中，直到总体积达到200 μ l。培养板上清楚地标有基本信息，包括接种密度和日期。随后，将培养板置于37℃、5%CO₂的细胞培养箱中继续培养。利用肝细胞固有的自组装特性，细胞自发聚集形成球状结构。在培养期间，每隔一天更换培养基，注意避免干扰球状体，以防止对细胞生长和球状体形成的任何不利影响。据观察，当以每孔1000个细胞的密度接种在96孔U形底超低附着板中时，所得球体致密并表现出良好的稳定性，保持完整而不崩解。此外，到了培养的第七天，球状体达到了最大尺寸，使得这种状态最适合进行后续实验。
（B）所示，选择第六代GFP标记的HepG2细胞用于该实验。器官芯片具有独特的结构，包括1.3 mm宽的中央主通道，两侧是横向介质通道，每个通道的宽度为0.5 mm。主通道充满纤维蛋白原和凝血酶，它们促进3D细胞生长。在混合物的制备过程中，将浓度为106细胞/毫升的99微升细胞悬浮液掺入预热的DPBS溶液中，然后依次加入浓度为15毫克/毫升的20微升纤维蛋白原溶液和浓度为100单位/毫升的1微升凝血酶溶液。充分混合后，将混合物注入器官芯片的主通道中，并在特定条件下孵育40分钟以促进凝胶化。随后，无菌使用连接到微注射泵的微泵延伸管以每小时10微升的速率连续向一侧的六个介质通道补充流体。这种设置允许DMEM培养基顺利渗透到主通道中，从而为细胞生长创造有利的环境。使用小型化活细胞监测系统监测细胞接种后的整个生长过程，视频1中详细介绍了生长过程。在37℃和5%CO2下生长4天后，将不同的药物单独添加到芯片中，然后在进行后续实验步骤之前再进行24小时的额外孵育期。
3D HepG2细胞模型中的分子毒理学测定结果。(a)途径科学假设图；(B)氧化应激和炎症相关结果；（C）与脂质代谢和肝功能相关的结果。
肝脏类器官的免疫荧光染色结果（a）肝脏类器官的免疫荧光病理图像；(B)ALB和ZO-1的荧光定量。
肝脏器官芯片的结果（a）肝脏器官芯片的免疫荧光病理图像；（B）肝脏器官芯片流出液的代谢组学分析结果。
