简介

        转染是研究生物学功能过程中不可或缺且经常使用的实验方法。因此，在大多数实验中，为了确保细胞样本适合下游应用，对细胞转染效率进行定性和定量评估，是一个常见且重要的实验环节。这项工作通常会涉及到荧光标记的使用，如绿色荧光蛋白（GFP）。

        通常研究者会使用荧光显微镜或单细胞分析技术，如流式细胞术，但是这种方法需要将细胞从培养皿中分离出来，对转染效率进行人工评估，而活细胞成像技术可以在原位对细胞表达进行分析。

        Tecan新推出的Spark®Cyto多功能酶标仪，内部整合了一台精密相机，可直接对酶标板中的细胞样品进行明场和荧光成像，并由功能强大且易使用的SparkControl™软件进行控制。SparkControl软件能够提供多种预定义的应用方案，并具有用户自定义功能，可以满足不同操作者的需求，使用灵活简便。

        SparkControl中的转染效率应用程序针对GFP转染细胞进行了优化，可配合使用蓝色核染料，如Hoechst 33342或DAPI（见图1）。

        该软件根据染色的蓝色细胞核自动检测单个细胞，并识别出那些显示额外绿色荧光的细胞，从中计算并实时显示转染效率百分比。

材料与方法

        将亲代和GFP转染的中国仓鼠卵巢细胞（分别是CHO和CHO- GFP）置于含10% FBS的Ham 's F-12培养基（Gibco， # 11765054）中， 于37℃，5% CO2的潮湿条件下进行培养。

        用胰蛋白酶/EDTA处理并收集两种细胞系细胞，计数准确的细胞数量。将已知的不同混合比例的转染和非转染细胞种到96孔板来模拟不同转染效率的样品，每孔200 μl总数10,000个细胞（表1）。这些细胞在荧光染色和图像采集前被静置一夜。

        检测前，所有细胞由 0.01 mg/ml的Hoechst 33342（Thermo Scienti‑c）避光室温染色30分钟。

        使用转染效率应用程序进行细胞成像，参数设置如表2所示。在本实验中，使用了4倍物镜和全微孔成像模式，不仅如此，这些参数还可以根据特定的孔板和图像分辨率要求而变化。图像采集参数分别为两个颜色通道进行了优化，如LED强度、对焦补偿和曝光时间等。当使用多个荧光标记时，必须纠正串色，因此含绿色标记细胞的参考孔也包含在内。

        除了成像分析外，还通过对同一孔进行多点测量的方式，从底部记录GFP信号的荧光强度。

        多功能检测和荧光成像能力的结合，使得细胞样品的可视化和功能性检测能够在同一实验中顺利完成。

结果

        图2显示了使用Spark Cyto的转染效率应用程序自动获取并评估的代表性图像。

        荧光成像测定的转染效率与荧光强度测量结果相关，在整个稀释范围内，两者呈良好的线性关系（见图3）。

结论

        Spark Cyto多功能酶标仪非常适合活细胞成像和细胞检测。本技术手册中的实验结果证实，为标准成像应用预定义的实验方案是确定细胞特征（比如：转染效率）便捷且可靠的工具。它包含的无缝衔接的实验方法设置、自动化处理以及结果的综合评价，能帮助研究者轻而易举地计算出每个样本的转染效率比。



（文章来源：hmez.huimeihealth.com.cn/hm/scrm/scrmmobile/eda/1654366202039160832）