简介

        对于许多细胞生物学应用，例如识别和分离高表达的克隆或敲除候选基因以及小规模生产抗体或蛋白，确保细胞株来源于单个细胞即其单克隆性非常重要。这可能是一个主要瓶颈过程尤其对于学术型实验室，由于自动化显微镜昂贵且操作复杂，单克隆性的验证通常使用显微镜手动进行。

        Tecan新的Spark®多功能酶标仪具有集成的明场成像模块，可使用一次性Cell Chips™（细胞芯片）进行细胞计数和活力分析。它可以对6至96孔微孔板板型孔内的细胞汇合度进行无标记物的实时评估，检测细胞覆盖区域，并计算相对汇合度。该成像功能由SparkControl™软件中直观易用的汇合度分析应用程序完成，通过用户自定义模式提供准确的检测（图1）。该功能专为中低通量的应用而设计，可在终点或动力学模式下进行汇合度检测，40分钟内可以完成96孔板的检测。用户可以根据实验需求，选择孔内的不同区域（图2），可以是每个孔中心的图像，或者一系列并排的图像形成的全孔成像。该软件可以自动进行孔边界检测，以弥补微孔板尺寸引起的差异。

        本应用指南介绍了使用Spark酶标仪利用自动成像、半自动图像分析和数据缩减，以经济有效的方式对96孔板中的细胞进行计数和微孔成像、验证细胞单克隆性。

材料和方法

细胞接种和生长

        HEK293细胞生长至70-90%汇合度，加入胰蛋白酶消化，并在正常培养基中重悬至10个细胞/ml的浓度。使用Spark酶标仪的细胞计数模块测定细胞浓度和活力（1）。将100 μl细胞重悬液铺至平底96孔细胞培养板的每个孔中。阳性对照则是将1E+04个细胞接种到微孔板的每个孔中。细胞每3-4天换液一次，直到细胞在每个孔中达到20-30%的汇合度（约需17天）。

成像采集和分析

        在接种后4小时进行图像采集，这时细胞轻微贴壁在孔的底部，此后每周进行一次成像，直到细胞达到预期的汇合度。SparkControl软件的设置包括全孔成像、孔边缘检测和数据分析，每个孔采集20张图像后整合在一起。使用全孔成像和孔边缘检测确保可以检测到沉降在孔边缘的单个细胞。使用“包含数据分析”功能时，系统会同时保存原始图像和处理后的图像。

        为了保证在图像采集过程中细胞具有最佳活力，使用酶标仪的环境控制模块，将检测室维持在37°C和5% CO2的环境中。Tecan的湿度盒的同时使用可以避免培养基蒸发。该系统的盖子升降器会在检测过程中自动移开湿度盒的盖子（不是培养板盖），确保实验过程中的无菌环境。

        为了鉴定细胞的生长，在Day 17手动筛选经自动分析的全孔图像中汇合度超过10%的。然后通过原始图像将阳性孔手动回溯到Day 1，鉴定单细胞克隆。注意：没有经过汇合度评估的原始图像用于手动评估，高质量的图像可以非常容易地识别单个细胞。

结果

         图3 显示一个具有鉴定的单细胞克隆的代表性的HEK293孔。

讨论和结论

        该实验结果展示了Spark酶标仪的细胞计数和微孔成像模块结合SparkControl软件应用于中低通量的半自动克隆成像和单克隆性验证的能力。该系统可以获得高质量的图像，在超过1,000多个孔的实验分析中仅出现一次自动聚焦误差。在第17天自动分析的汇合度水平成功地用于鉴定细胞菌落，然后目视检查并确定这些细胞是否来自单细胞克隆。该方法的成功表明，Spark酶标仪作为一种理想的低成本解决方案，可以取代通过显微镜进行的繁琐的手动单克隆性验证。

参考文献

(1) Fast and accurate cell counting in a multimodemicroplate reader, 398570 V1.0. 12-2014


（文章来源：hmez.huimeihealth.com.cn/hm/scrm/scrmmobile/eda/1654361814799675392）