简介

        HTRF是基于时间分辨荧光共振能量转移（TR-FRET）的检测系统，广泛用于分析不同分子间相互作用和结合的研究。该技术基于长寿命的铕或铽穴合物供体与各种红色或者绿色受体间的能量转移，并结合了FRET和TRF两种技术的优势。

        HTRF技术需要多功能酶标仪具备很高的灵敏度，Spark酶标仪的一系列特性可以满足这些需求，并确保最佳的分析性能。Tecan独特的融合光学系统，在同一机身上整合了滤光片的灵敏度和单色仪（MCRs）的灵活性。除了单独完全使用基于滤光片型检测或MCR检测外，还可以在同一次检测中同时组合使用这两种检测方法。自动Z轴优化和集成二向色镜非常适合HTRF检测，进一步提高了Spark卓越的灵敏度。本应用指南描述了配备标准荧光组件的Spark酶标仪用于HTRF检测的验证。

材料与方法

        • 带标准荧光模块的Spark多功能酶标仪（Tecan，奥地利）

        • 384孔小体积微孔板，黑色和白色（Greiner® Bio-One，

德国）

        • HTRF酶标仪质控试剂盒 （Perkin Elmer cisbio，法国）

        • cAMP HiRange检测试剂盒（Perkin Elmer cisbio，法国）

        • Human TNFα检测试剂盒（Perkin Elmer cisbio，法国）

        • IP-One Tb检测试剂盒（Perkin Elmer cisbio，法国）

     • cAMP-green酶标仪质控试剂盒（内部使用非商用，Perkin Elmer cisbio，法国）

HTRF 酶标仪质控试剂盒(RCK) 

        HTRF酶标仪质控试剂盒旨在设置和验证仪器进行HTRF测量的兼容性。它包含评估单台酶标仪性能所需的所有试剂和缓冲液，也可用于不同仪器的比较。

Human TNFα检测试剂盒

        肿瘤坏死因子- α (TNFα)是一种由活化的巨噬细胞和单核细胞分泌的细胞因子，作为急性期免疫应答的一部分参与全身炎症反应。

        该检测试剂盒允许通过抗体介导识别用HTRF供体和受体荧光基团标记的两个不同的表位来定量细胞或上清液中的TNFα。HTRF比值随TNFα浓度呈线性增加。

cAMP HiRange检测试剂盒 

        环腺苷酸（环腺苷酸3' -5' -单磷酸，cAMP）是细胞内最重要的信使分子之一，参与蛋白激酶或离子通道的激活等多种生物过程。本试剂盒设计用于通过竞争性免疫分析方法直接定量悬浮细胞或贴壁细胞中的cAMP，可检测不同细胞系中GPCRs(G蛋白偶联受体)的激动剂和拮抗剂作用。HTRF信号与样品中cAMP浓度成反比。

IP-1 Tb检测试剂盒

        G蛋白介导的信号传导通路主要有三种，通过G蛋白的四个亚型来介导：Gs、Gi、Gq和G12/13。Gq在GPCR刺激后诱导磷脂酶C(PLC)激活，触发IP3（三磷酸肌醇）的生成。IP1（磷酸肌醇，IP3的下游代谢物）会在Gq受体激活后在细胞中积累。它在氯化锂(LiCl)存在下是稳定的，因此是GPCR (Gq)功能试验的理想选择。

        IP-One Tb试验是一种竞争性免疫检测，使用铽穴合物标记的抗IP1单克隆抗体和d2标记的IP1检测累积的IP1。信号比与样品中IP1浓度成反比。

试验方案

        所有试剂盒都是根据试剂制造商的说明使用的。为了验证铽供体/绿色受体结构，将cAMP直接偶联到绿色受体，与铽供体偶联的抗cAMP抗体结合使用。每种试剂盒在384孔微体积板(白色和黑色)中检测三次，每孔填充20μl。Spark通过使用融合光学滤波片/滤光片组合，以及激发侧的MCR和发射侧的滤波片进行了验证。

        使用铕穴合物供体的试剂盒- RCK、cAMP HiRange试剂盒和TNFα试剂盒的检测参数见表1。

使用铕穴合物供体的检测参数

        使用铽穴合物供体（IP-One Tb试剂盒和cAMP + 绿色受体）的检测参数详见表2。

        使用铽穴合物供体的检测参数

实验结果

HTRF酶标仪质控试剂盒

        在发射端选择滤光片的条件下，Spark酶标仪呈现非常好的RCK实验结果。而激发端选择滤光片和MCR均符合Cisbio的接受标准。因此在滤光片/滤光片和单色仪/滤光片两种组合下对Spark酶标仪的HTRF进行验证。

     结果显示，Spark酶标仪适用于HTRF分析。在两种检测模式下，使用白色酶标板和黑色酶标板，Spark酶标仪均符合Cisbio的RCK 检测标准（表3）。使用白色酶标板和黑色酶标板，所有设置均显示非常好的检测范围（FLow  37%，ΔF High ≥ 1,045%）和最小的检测误差（所有校准器和标准的CVs 滤光片/滤光片组合 ≤ 3.1%，单色仪/滤光片组合 ≤ 6.3%）。

Human TNFα 检测试剂盒

        Human TNFα 检测试剂盒是验证过程中最灵敏的测试方法，需要高灵敏度的酶标仪。根据评估方案，TNFα的检测极限是基于校准系数1到3计算。在滤光片/滤光片组合下，使用白色和黑色酶标板的检测极限均低于20 pg/ml。单色仪/滤光片组合下，使用白色酶标板超过Cisbio的标准（表4）。因此单色仪/滤光片组合下的检测使用白色酶标板，滤光片/滤光片组合下可使用白色和黑色酶标板，TNFα稀释检测在20和100pg/ml之间呈现线性关系（R2 ≥ 0.9979）(图1)。

cAMP HiRange 检测试剂盒

        如图2所示，cAMP稀释系列得到的F值与cAMP浓度呈负相关。得到的S型曲线是典型的竞争法测定结果。具体的测试结果详见表5。在每一种情况下，实现了信号空白比20的足够的动态范围，EC50值<25 nM。白色酶标板在两种融合光学配置下呈现非常好的实验结果，而黑色酶标板在滤光片组合下的F和S/B值更低。

IP-One Tb 检测试剂盒

        IP-One Tb试剂盒用于分析Spark在检测铽穴合物供体与红色受体实验的性能。在滤光片/滤光片和单色仪/滤光片组合下使用白色酶标板以及滤光片/滤光片组合下使用黑色酶标板均符合Cisbio的性能标准（表6）。图3显示典型的IP1标准曲线。使用白色酶标板在滤光片/滤光片组合下达到最好的性能，其他条件下的检测结果显示减少的F、S/B和EC50值。

cAMP green 酶标仪质控试剂盒

        cAMP green 酶标仪质控试剂盒使用与cAMP绿色受体偶联的铽抗cAMP共轭物。该试剂盒用于分析Spark酶标仪的HTRF（铽供体和绿色受体）检测性能。所有的融合光学组合符合Cisbio的标准（表7），但在不同的组合下，黑色微孔板的S/B和EC50值略低于白色微孔板。黑色微孔板在竞争性实验曲线中的F值也明显偏低（图4）。

结论

        创新型Spark多功能酶标仪采用Tecan独特的融合光学系统提供给客户更优的解决方案。

        激发和发射均选择滤光片的条件下，系统在白色和黑色酶标板上呈现优质的实验结果。在激发端选择MCR和发射端选择滤光片的条件下，使用白色酶标板也符合HTRF的检测标准。因此这些组合可视为通过了HTRF验证。除了铕供体的试剂盒外，使用铽供体加红色和绿色受体也可进行稳定灵敏的定量。

        综上所述，本文的研究结果表明，采用独特融合光学系统的Spark酶标仪采用滤光片作为发射端，完美适用于各种不同的HTRF荧光检测。

缩略语表

lHTRF    均相时间分辨荧光

lTRF       时间分辨荧光

lFRET     荧光共振能量转移

lMCR     单色仪

lRCK      酶标仪质控试剂盒

lcAMP    环腺苷酸3' -5' -单磷酸

lIP3        三磷酸肌醇

lIP1         磷酸肌醇

lGPCR     G蛋白偶联受体

lTNF­        肿瘤坏死因子- α

lPLC         磷酯酶C