简介

        钙离子（Ca2+）是细胞内信号转导中重要的第二信使，参与基因表达、增殖、分化和细胞死亡等关键细胞过程。Ca2+浓度在细胞外（1.5 mM）和细胞内（胞浆内100 nM）以及细胞内结构之间存在显著差异。细胞外Ca2+进入细胞内或者内质网释放存储在细胞内的Ca2+，会使胞浆内Ca2+浓度增加，从而启动细胞内Ca2+信号通路。质膜上还有几个离子通道控制Ca2+从细胞外进入细胞内，例如电压门控钙通道（VGCCs）。

        细胞内异常的Ca2+信号传导和Ca2+紊乱与多种疾病有关，包括神经退行性疾病和各种癌症。此外，钙离子通道的高水平表达与治疗性抗拒、干细胞状态、自我更新和癌细胞的迁移能力有关。几种常见的化疗药物会干扰癌细胞中的Ca2+稳定性和Ca2+信号传导。因此，对细胞内Ca2+的监测是一种有用且应用广泛的实验方法。

        Fluo-4是一种经典荧光染料用于监测细胞内Ca2+，其与Ca2+结合后绿色荧光增强。将溶解好的Fluo-4直接添加到含有培养细胞的微孔板中，细胞可以载入乙酰氧基甲酯（AM）形式的Fluo-4，然后可以通过标准荧光检测或基于荧光的细胞成像检测Fluo-4。

        在Spark Cyto上可以同时实现这两种功能。该系统是第一台活细胞实时成像酶标仪，可实现细胞培养的半自动化实验流程。它将多功能检测模块和荧光成像相结合，可以在单个实验中对细胞样本进行可视化和功能检测。

        Spark Cyto配备了高端成像模块，包括三个可选的物镜、四个荧光通道、一个LED照明和高度可靠、快速自动的聚焦系统。通过用户友好和直观的SparkControl™软件，Spark Cyto可以实现动力学分析的自动化，如全环境控制、动力学软件和动态调节能力，为复杂的实验设计提供了一套简单的解决方案。

        本文描述了一种使用Spark Cyto多色荧光成像和ImageAnalyzer™软件分析胞内Ca2+浓度和Ca2+摄取的半高通量方法。通过钙离子载体-离子霉素处理增加细胞内Ca2+浓度，用Fluo-4结合使用细胞核染料Hoechst 33342进行定量检测。

材料和方法

细胞培养

        KKU-055细胞（人胆管癌细胞系；JCRB）在标准细胞培养条件下（37°C，5%CO2），在DMEM培养基（Gibco）中，生长至约80%汇合度。DMEM培养基中添加10%胎牛血清（FBS，Biochrom），1%抗生素-抗真菌溶液（ABAM，Merck），1mM丙酮酸钠（Merck），以及10mM HEPES（Merck）。

试剂

        将Hoechst 33342溶液（20 mM，ThermoFisherScienti‑c）、Fluo-4、AM（ThermoFisher Scienti‑c，溶解于DMSO中至1 mM的浓度） 和离子霉素（Merck，溶解于DMSO中至1 mM的浓度）分装，并在-20°C下储存。

染色和离子霉素处理

        用胰蛋白酶/EDTA（Merck）处理收集细胞，并以每孔7500个细胞的密度接种在96孔板（Tecan）中，过夜培养。用无血清的DMEM（sfDMEM）清洗细胞一次，加入Hoechst 33342（1μM）和Fluo-4（0.5μM），在细胞培养箱中培养10分钟。在培养孔中添加离子霉素（1μM）后立即开始检测。

仪器

        Spark Cyto 600

检测方案和分析

        荧光成像（蓝色通道检测Hoechst细胞核染料，绿色通道检测Fluo-4阳性细胞）通过动力学循环（5个周期，每个周期2分钟）检测胞内Ca2+的时间依赖性变化。为了分析单细胞水平的胞内Ca2+，并验证实验方案的动态适用性，动力学循环设置一个条件（每孔计数5000个带绿色荧光的细胞）。使用Image分析软件的Voronoi分析功能分析双阳性细胞，并确保单细胞水平的可靠测量。为了评估Voronoi分析的特异性，同时使用了多色荧光成像仪的分析功能，两者选用相同的分析选项设置。有关详细设置，请参见图1。

数据统计

        所有数据点代表7次重复的平均值，±标准平均误差（SEM）。使用OriginPro®2019b（OriginLab）进行计算。

结果和讨论

        使用动力学循环功能，可以可靠地监测离子霉素处理后细胞内Ca2+的增加，并为随后在单细胞水平上分析细胞内Ca2+定义了一个条件（5000个绿色荧光的细胞）。实验数据如图2所示。

        为了在细胞水平上检测钙流的大小，把多色荧光成像与Voronoi分析相结合。同时检测蓝色和绿色的双阳性细胞，代表胞内钙流增加。此外，为了检测Voronoi分析的特异性，对常规（非Voronoi）分析进行了相同的实验。

        正如预期的那样，分析模式（Voronoi与非Voronoi）对与核染色相关的结果没有影响（图3）。然而，与非voronoi相比，Voronoi分析导致了“带绿色信号的蓝色目标计数”（即双染色细胞，见图4）的值相对更低。如图5所示，这种现象是由于Voronoi分析的特定算法，从而减少了假阳性。非Voronoi分析会产生重叠计数事件，因此会产生假阳性信号（图5，上），而使用Voronoi分析可以更精确地解决这些重叠计数事件（图5，下）。

结论

        将多色荧光成像与Voronoi分析相结合是实时测量细胞水平钙离子变化的可靠工具。此外，结合Ca2+敏感染料和核染色可以在细胞水平上分析细胞内Ca2+。在这个设置中，Voronoi分析优于非Voronoi分析，因为它最小化了假阳性结果。这里提供的方案是可扩展的，适用于半高通量的应用。



（文章来源：hmez.huimeihealth.com.cn/hm/scrm/scrmmobile/eda/1654332953925570560）