简介

        严重急性呼吸综合征冠状病毒2型(SARS-CoV-2)由于其传播速度快，已成为全球关注的问题。目前，通过细胞培养监测和量化SARS-CoV-2感染的方法既耗时又费力。然而，法兰克福大学创建的睡美人转座子系统——一个强大且多功能的细胞感染模型，可使研究人员能够低成本高效率地在体外高通量监测SARS-CoV-2的复制。

        本应用指南来自于法兰克福大学于2021年7月发表在《微生物学前沿》上的一篇论文。该研究描述了使用SparkCyto开发细胞模型，实现针对SARS-CoV-2的高通量研究。

        Spark Cyto全自动实时活细胞成像系统用于本次研究，它的成像模块包含三个可选择的物镜和四个荧光通道。该仪器的照明和自动对焦系统都是基于LED，可以在微孔板中实现高质量的明场成像。该研究还充分利用了Spark Cyto的高度灵活性，实现了在受控环境下长达198小时的活细胞成像，使用明场和红色荧光通道监测SARS-CoV-2复制诱导的细胞病变效应(CPEs)。

        该系统的易用软件 SparkControl™提供各种功能，包括调节温度、CO2和蒸发保护等环境控制，以及动力学实验的设置。这些功能支持复杂的细胞分析，包括细胞活力、凋亡、转染效率和细胞死亡。在这些应用中，汇合度评估提供了一个有效的无标记替代方法来评估细胞的生长行为。在SparkControl的conuence应用程序中可以获得粗糙度系数，它提供了一种简单的细胞毒性、细胞分裂，甚至是微孔中的细胞被细菌或酵母污染水平的测量方法，而不需要进行荧光染色（图1）。SparkControl将粗糙度系数计算为包含一个或多个细胞的所有分离区域的像素强度的归一化平均标准偏差。无量纲化的粗糙度系数的值可以在零到无穷之间，并可以与专有的图像分析软件Image Analyzer™结合，提供对象遮罩的简单优化，以微调结果。

        在细胞培养过程中研究细胞的各种特性，以构建和表征一个合适的细胞系。例如，选择高转染效率和对胰蛋白酶有良好反应是至关重要的。为此，我们用GFP编码质粒转染细胞，利用绿色荧光计数功能来评估转染效率。用胰蛋白酶处理融合细胞，DAPI染色计数法检测细胞分离情况。结合其他特点，如对干扰素处理有适当的反应，最终选择细胞株A 5 4 9 来生成体外模型。然后对选定的细胞株进行SARS-CoV-2感染研究。

        CPEs表明感染病毒引起的宿主细胞结构变化，是通过汇合度减少和粗糙度评估确定的。与汇合度的减少相比，由于SARS-CoV-2诱导的细胞形态改变，粗糙度系数有更大的增加。这是由于SARS-CoV-2糖蛋白介导的膜融合形成合胞体所致。

        SARS-CoV-2的进入宿主细胞高度依赖于ACE2受体和TMPRSS2蛋白酶的表达。为了监测这一点，A549-AT细胞中另外含有一个dTomato的序列作为ACE2组成性表达构建的一部分，允许用红色荧光成像检测SARS-CoV-2诱导的细胞溶解。该方法被用于确定单克隆中和抗体(mAbs)的有效性，证明该细胞系适合用于药物筛选和病毒学分析。

结果

        通过抗体介导的免疫荧光检测病毒蛋白，证明所观察到的汇合度变化、粗糙度增加和红色荧光减少是由病毒特异性诱导的。

        在SARS-CoV-2研究中，高通量细胞模型的主要前提是容易培养、良好的重现性和明显的干扰素反应。在评估了不同细胞株对I-III型干扰素反应的敏感性后，初步选择了两种合适的候选细胞株A549和Caco2，并根据增殖率、胰蛋白酶消化和转染效率进一步分析细胞培养特性。在Spark Cyto上使用自动汇合度测量和细胞计数功能，在16天的时间内监测细胞生长。人肺上皮细胞株A549在第8天达到完全汇合。此外，A549在分裂实验前的分离时间明显缩短，且转染效率高于Caco2细胞。数据证实，A549细胞在高通量分析中表现出适合作为研究SARS-CoV-2感染的细胞模型的特征。

        ACE2和TMPRSS2是SARS-CoV-2进入病毒细胞的必要受体，利用促芽孢杆菌素S脱氨酶（BSD）作为选择标记，构建出有ACE2- dTomato表达的A549（图3）。在EF1 α启动子的控制下使用类似的构建，用蓝色荧光蛋白(BFP)和湿霉素抗性基因单元(HygR)组成表达TMPRSS2。采用流式细胞术对不同表达水平的细胞进行分选。经检测发现A549-ACE2高 / TMPRSS2低细胞(A549-AT)是SARS-CoV-2引起的CPE变化最明显的细胞系。

        用SARS-CoV-2菌株FFM1（2020年初从中国武汉的一名个体中分离）感染细胞，并进行RT-qPCR分析。检测到可作为活性复制和病毒释放的替代标记物的特定病毒mRNA，表明生产性感染也会导致细胞培养上清液中产生感染性病毒。

        使用Spark Cyto的自动细胞成像系统监测非侵入性SARS-CoV-2复制。再次用SARS-CoV-2 FFM1毒株感染细胞，仅在感染后12小时观察到CPE的形成和汇合度的减少（图4）。由于合胞体的形成和细胞裂解，粗糙度系数增加。细胞粗糙度是估计CPE的一个很好的标记，因为它出现在汇合度变化之前。

        A549 - AT 细胞用于显示各种SARS-CoV-2分离株的CPE，包括Alpha (B.1.1.7)、Beta (B.1.351)和Zeta (P.2)变异株，这些变异与更高的传播或免疫逃避有关。除了汇合度减少和粗糙度系数增加外，病毒感染时dTomato信号的丢失是监测CPE形成的另一种节约时间和资源的高效读取方法。

        所有这些数据表明A549-AT模型细胞株适用于各种自动化读取方法来确定SARS-CoV-2的复制。接着对构建的细胞株进行了评价和测试以确定其在药物筛选中的可用性，包括抗病毒药物和单克隆抗体筛选。首先用瑞德西韦和卡莫司他处理细胞，这导致了病毒复制的显著减少（数据见参考文献原文图6）。由于单克隆抗体和患者源血清的中和滴度是影响SARS-CoV-2免疫的重要因素，因此采用A549-AT细胞进行相互抗体滴度测定。商业单抗bamlanivimab (LY-CoV555)可以有效地中和SARS-CoV-2变异株B.1.1.7以及2020年初的分离株B。通过测量细胞汇合度和粗糙度系数，以及dTomato表达的荧光测量—称为相对荧光强度(RFI)——可以观察到中和抗体对CPE形成的浓度依赖性效应。然而，对B.1.351或P.2变异株均不存在中和效应（图5）。这些数据表明，自动化评估中和抗体的效力是可行的。

结论

        自动化无创光学读取方法，包括对汇合度和粗糙度系数的评估，以及dTomato的荧光测量。此外，本文还进行了活细胞成像和长期动力学研究。Spark Cyto的高灵活性非常适合于自动化，可对SARS-CoV-2感染进行高通量、低成本的研究。综上所述，A549-AT细胞适合作为SARS-CoV-2感染研究中的高通量模型细胞株。这些数据进一步强调了该细胞株可用于筛选抗病毒化合物， 以及研究针对不同SARS-CoV-2变种的中和抗体的有效性。

参考文献

        Widera, M et al. Generation of a Sleeping BeautyTransposon-Based Cellular System for Rapidand Sensitive Screening for Compounds andCellular Factors Limiting SARS-CoV-2 Replication.Front Microbiol, 2021, 12 , July. doi: 10.3389/fmicb.2021.701198.

        Toptan, T et al. Optimized qRT-PCR approach forthe detection of intra- and extra-cellular SARS-CoV-2RNAs. INT J MOL SCI, 2020, 21 (12), 4396. doi.org/10.3390/ijms21124396.



（文章来源：hmez.huimeihealth.com.cn/hm/scrm/scrmmobile/eda/1654352961670008832）