简介

     蛋白质之间的动态相互作用是多种细胞功能的关键媒介，几乎与所有的生物过程都相关。因此，它们是研发新型药物治疗的有价值靶点。在这种背景下，Promega开发的生物发光共振能量转移（BRET）是一种成熟的检测技术，用于研究活细胞中的蛋白质相互作用。然而，由于其有限的动态范围和灵敏度，其应用推广至今仍受到一定的阻碍。

        随着最新的极其明亮的NanoLuc®荧光素酶的出现，用其与一种带有长波长荧光团的细胞内蛋白质结合的标记方法， P r o m e g a 将B R E T 技术带到了一个新的水平：NanoBRET™。

        由于其尺寸小（19 kDa）、发射强度高且光谱（460nm峰值强度）相对狭窄，NanoLuc®荧光素酶成为理想的能量供体。一种高效红光发光受体荧光团（635nm峰值强度）使整个BRET光谱分离超过175nm（见图1）。相比其他BRET分析技术，它整合了更大的光强度与改进的光谱分辨率，因此显著提高了检测结果的灵敏度，并使其达到了更高的动态范围 [1]

        NanoBRET™靶位结合细胞内HDAC试验，测试的是完整细胞内可与选定目标HDAC蛋白结合的化合物的亲和力，该化合物可竞争性地取代细胞中与NanoLuc®融合蛋白可逆结合的NanoBRET™示踪剂。随着最新的极其明亮的NanoLuc®荧光素酶的出现，用其与一种带有长波长荧光团的细胞内蛋白质结合的标记方法， P r o m e g a 将B R E T 技术带到了一个新的水平：NanoBRET™。

        在试验的第一步，向表达所需NanoLuc®融合蛋白的细胞中加入固定浓度的示踪剂。竞争性化合物的引入导致NanoBRET™能量转移的剂量依赖性下降，以此估计靶蛋白的胞内亲和力。NanoBRET™TE细胞内HDAC试验评估化合物与组蛋白去乙酰化酶（HDAC）—NanoLuc荧光素酶融合蛋白[2]的结合。在本应用指南中，我们在Spark多功能酶标仪上演示了用于评估化合物与HDAC6（一种与癌细胞转移和肿瘤发生相关的组蛋白去乙酰化酶）结合的方法。

        Spark酶标仪是Tecan公司的多模块检测平台，可为基于发光的检测应用提供卓越的性能，包括闪光和辉光发光、多色发光和发光扫描[3,4]。专用光电倍增管（PMT）允许单光子计数，消除了通常与使用单个PMT进行荧光和发光测量的仪器相关联的灵敏度和动态范围之间的冲突。这种独特的光学组合成就了优越的灵敏度，可与独立的光度计相媲美。该酶标仪配备了专门针对NanoBRET应用的优化升级款发光滤片。

        本应用指南总结了使用Spark酶标仪和NanoBRET检测技术实施NanoBRET™靶位结合细胞内HDAC试验的一系列测试结果。

材料和方法

• HEK293细胞稳定表达HDAC6-NanoLuc®融合蛋白
• NanoBRET™ TE细胞内HDAC检测试剂盒（Promega,Cat# N2080）
• 包括NanoBRET™Nano-Glo®底物，示踪稀释缓冲液，NanoBRET™细胞内TE HDAC示踪剂，和细胞外NanoLuc®抑制剂
• Opti-MEM® I减血清培养基，无酚红（Fisher, cat#11058021）
• SAHA （亚酰基苯胺羟肟酸）/ Vorinostat（Sigma, cat#
SML0061, 配制为10mM DMSO原液）
• Panobinostat （Selleck Chemicals, cat# S1030, 配制为10mMDMSO原液）
• Costar® #3917 96孔白色带盖组织培养处理板（Fisher, cat#07-Spark-628）
• 各种单通道和多通道移液器和枪头，移液槽

        将HEK293细胞稳定表达HDAC6-NanoLuc®融合蛋白在不含血清或酚红的Opti-MEM培养基中重悬至密度为2x105个/mL。将85μl的细胞悬液（17,000个细胞/孔）转移到康宁实验板的孔中。将80 μl的NanoBRET™细胞内TE HDAC示踪剂和320 μl的示踪稀释缓冲液结合制成20X NanoBRET™示踪剂，在所有实验孔中加入5 μl的NanoBRET™示踪剂。 

         将10mM原液含有Panobinostat和亚酰基苯胺羟肟酸（SAHA）测试化合物在Opti-MEM中稀释至200 μM，然后在Opti-MEM中按1:3连续滴定，形成10X浓度11-pt剂量反应滴定。将稀释后的化合物10 μl一式三份加入实验孔中。不含化合物的对照孔中也添加10 μl培养基。

        将检测板以700转/分的速度混匀振荡15秒，然后置于37°C/5% CO2培养箱中孵育85分钟。 

        孵育后，将测定板从培养箱中取出，使其在室温下平衡15分钟。

        在室温平衡过程中，将30 μl的NanoBRET™Nano-Glo®底物和10 μl的胞外NanoLuc®抑制剂与4.96 ml不含血清或酚红的Opti-MEM结合制成3X完整底物加抑制剂溶液。在所有实验孔中加入50μl 该3X完整底物加抑制剂溶液。

        将检测板以700转/分的速度混匀振荡15秒，然后在室温下孵育2分钟，然后测量NanoBRET。 

        根据试剂盒说明书[2]制备NanoBRET TE细胞内HDAC检测试剂盒并移液到Costar白色96孔平底微孔板中，总检测量为150 μl。在In nite Spark上进行检测的参数设置如表1所示。

结果和讨论

        使用Spark对每个微孔依次读取供体和受体波长。手工计算BRET比值，将比值结果乘以1000转换为milliBRET单位（mBU）。

        已知的HDAC抑制剂Panobinostat和SAHA都会与HDAC6结合，导致BRET比值的剂量依赖性变化。高浓度的两种化合物取代了细胞内的HDAC示踪剂，导致BRET[3]降低。测得Panobinostat和SAHA的EC50值分别为1.42 μM和0.54 μM（见图3）。随着药物浓度的稀释，对示踪剂结合的竞争变得不那么明显。较低浓度的化合物取代较少的示踪剂，使得供体NanoLuc®荧光素酶和示踪剂之间发生能量转移。

        总之，供体（NanoLuc®荧光素酶）和受体（示踪剂）的发光信号过滤后的波长均可被检测到。因此，Spark多功能酶标仪是适用于NanoBRET™检测的。

参考文献

        1) Machleit et al. NanoBRET–A novel BRET platform for

the analysis of protein-protein interactions. ACS Chem.

Biol., 2015, 10 (8), pp 1797–1804

        2) NanoBRET™ Target Engagement Intracellular HDAC

Assay. Technical Manual/Instructions for Use. 6/16,

TM483 (Promega)

        3) Unparalleled flexibility for luminescence detection wit h

the Spark™ multimode reader. Technical Note. 398597

V2.0. 01-2017 (Tecan)

        4) Spark® multimode reader - luminescence sensitivity.

Optimizing the detection limits for flash and glo w

luminescence. Technical Note. 398751 V2.0. 01-2 017

(Tecan)

        5) Implementation of NanoBRET assay technology the

Infinite 200. Application Note. 400193 V1.0 04 -2017

(Tecan)


（文章来源：hmez.huimeihealth.com.cn/hm/scrm/scrmmobile/eda/1654307552964694016）