简介

      活力测定是细胞生物学实验室常用的一种筛选工具，用于评估细胞系对感兴趣化合物或不同生长条件的反应。确定细胞活率有很多种方法，其中有一些方法可以提供“全孔”的信息-例如ATP生物发光检测，或使用MTT、WST-1或刃天青的比色分析。同时，也有一些方法是基于荧光成像技术在个体水平上对活细胞和死细胞进行区分。基于细胞膜的通透性和细胞核的可及性，这些荧光活率标记物通常会与适当的细胞死亡标记物结合。

       Tecan推出的Spark Cyto细胞成像系统整合了酶标仪的多功能检测能力和精密的成像模块，可以直接对微孔板中的细胞样本进行明场和荧光成像。它可以在同一实验中完成细胞样本的可视化和功能性检测分析。该系统含有功能强大且易用的SparkControl™软件，它已具有许多预定义的方案，能简化常见的基于细胞分析的实验设置。这其中包括使用酯化钙黄绿素结合碘化丙啶（PI）的细胞活率应用。酯化钙黄绿素是一种非荧光的透膜性化合物，通过活细胞细胞质中的酯酶活性裂解产生绿色荧光的不可透膜化合物钙黄绿素。相反，PI在活细胞中是不透膜的，可以根据其红色荧光检测死细胞。

       本技术手册介绍了经二甲基亚砜（DMSO）或皂素处理后，人宫颈癌（HeLa）细胞活率的准确且快速的定量方法。

材料和方法

       在37°C和5% CO2的潮湿环境中，HeLa细胞在添加过1 0 % 胎牛血清（F B S ） 的R P M I 培养基（ G i b c o ，#12633012）中生长汇合。然后，使用胰蛋白酶/EDTA收集细胞，计数并播种到24孔板中，每孔的细胞数为5 × 104个细胞，培养液为500μl。将细胞置于标准的孵育条件下过夜。

       在初始试验中，加入DMSO至终浓度为2 0 %或4 0 %（v/v），37℃孵育细胞45 min诱导细胞死亡。在第二次试验中，将不同浓度的皂素（0.05%和0.2% v/v在培养基中）在37℃条件下作用10 min。在这两种情况下，未处理的对照微孔都包括在内。

       荧光染色时，将酯化钙黄绿素和PI的工作液用PBS稀释至终浓度分别为100 ng/ml和1 pg/ml。将染色液直接加入细胞样品（300μl/孔），室温下避光孵育30分钟。用于串色校正仅用PI染色的孔也包括在内。

       使用细胞活率应用程序进行图像采集，参数设置如表1所示。在Live Viewer™（可通过方法编辑器访问）中对曝光时间、LED强度和对焦补偿等参数进行了优化，以确保在每个颜色通道中都能检测到足够的荧光强度，而不会过度曝光。通过测定仅用PI染色良好的参照样品的绿色荧光信号，并最大限度地减少该通道中的光量来进行串色校正。

       我们通过使用Method Editor或Image Analyzer中的长度、宽度和识别灵敏度设置，来优化绿色和红色物体的检测率。

        表1：使用绿色和红色荧光通道，评估细胞活力的检测参数设置。

结果

       添加浓度为40%的DMSO可导致细胞活率显著下降，同时PI阳性细胞数量从背景水平增加到50%左右。然而，浓度为20%的DMSO对这个著名且健壮的细胞模型影响很小（图1）。此外，添加浓度为40%的DMSO导致死亡细胞从微孔表面分离，可能会高估活率水平（如图2所示），总体可以看到处理孔比对照孔的细胞更少。

       相比之下，相对较低浓度的皂素会立即导致膜丧失完整性，但不会使细胞从孔板表面脱离。处理后细胞活率约有10%的显著下降，其皂素含量为0.2%（图3），大多数细胞PI染色呈阳性（图4）。

       细胞活率的评估也可以随着时间的推移进行，例如动力学检测。对于这种应用，建议使用环境控制功能，如对温度和湿度进行控制，以及为细胞株选定适当的CO2压力。然而，根据细胞株的不同，还应注意的是，钙黄绿素会在染色数小时后会被主动运送出细胞外。

结论

        Spark Cyto预定义的细胞活率应用程序提供了一个可靠且易于使用的方式，来检测和定量化合物的细胞毒性效应，如文中DMSO或皂素对HeLa细胞的影响。该系统的ImageAnalyzer软件可以直接优化绿色和红色物体的识别灵敏度。此外，还可以通过调节大小或强度的门控来排除过度曝光的物体或伪影的干扰。


（文章来源：hmez.huimeihealth.com.cn/）