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蛋白质组学研究内容主要是解析基因组全部的蛋白质组，并通过蛋白定量和定性上变化反映细胞、器官和有机体的生理变化；转录后调控和翻译后修饰使得组成蛋白的数量远远大于组成基因的数量。随着生物质谱技术迅速发展，质谱技术已经逐渐成为了蛋白质组学分析的主流技术。

近期蛋白组学领军人物Matthias Mann团队在《Molecular & Cellular Proteomics》特约专栏发表了题为“MS-Based Proteomics of Body Fluids: The End of the Beginning”【1】的最新综述，总结了不断成熟的样本前处理、蛋白检测、数据分析方法，展望了基于质谱的体液蛋白质组学走向临床应用的广阔前景。

a) 扩展性、稳健性和重复性：
在体液蛋白质组学中，考虑到不断增长的研究队列，在可管理的时间框架内确保一致、无污染和可靠的样品制备质量尤为重要。事实上，体液的应用总体上推动了基于质谱的蛋白质组学的品质追求。如今，全自动或半自动化的液体处理机器人已经得到了广泛的应用。同时，样品制备过程也得到了简化和精简。

b) 高丰度蛋白挑战：

在血浆或血清中，以及在较小程度上在其他体液中，少数高度丰富的蛋白质占了定量肽强度的绝大部分，极大地损害了较少丰富的蛋白质的检测【2】。面对高丰度蛋白的挑战，除了常规的去除高丰度蛋白排除其信号干扰以达到检测低丰度蛋白的目的，还有通过具有特定表面化学结构的纳米颗粒也被用来选择性地富集低丰度的蛋白质。例如Seer平台基于磁珠富集的ProteoMiner蛋白富集试剂盒，当样本分成多组分进行检测时，可以达到数千个血浆蛋白的鉴定深度【3】。

体液蛋白质组学的最新工作流程改进

二、蛋白检测

a) DIA:

近年来，质谱仪和采集方案共同发展，数据独立采集(DIA) 质谱的成熟和广泛采用标志着一个重要的里程碑。这一进展主要是由新算法和高性能质谱仪的发展推动的。DIA固有的定期采样所有前体的能力使得肽片段离子的采样更加均匀，从而提高了数据的完整性，增强了蛋白质组的深度，并提高了灵敏度。

b) 多路参考信道:

非等压多路DIA (mDIA)是最近的一项发展，有望将DIA的优点与多路复用的优点结合起来。这里用二甲基试剂创建了MS1可识别的通道，允许将样品汇集起来进行测量，并添加参考蛋白质组。通道因其特有的质量位移而相互联系。在每个质谱测量中，参考蛋白质组的鉴定延续到样品通道，消除了对其鉴定的需要。此外，参考通道可以实时监控分析性能。由于在所有样本中都是相同的，因此它可以作为研究样本之间甚至研究和实验室之间进行定量比较的桥梁。不同的参考蛋白质组也可以相互“翻译”或通过一起测量来“协调”。对于绝对定量，参考蛋白质组中的蛋白质子集可以与绝对标准相关。

c) 亲和结合物:

在过去的几年中，亲和结合剂技术已被广泛用于测量大型临床血浆或血清队列——主要是Olink的基于抗体的邻近延伸测定(PEA)或SomaLogic的基于DNA适配体的SOMAscan测定【4】。许多质谱研究都是小型的和专门的，而亲和结合剂研究是相当昂贵的，但仍然被用于大型队列。

d) 生物标志物panel

多种生物标志物的组合被称为“体外诊断多变量指数测定”。无偏好性的蛋白质组学通常会产生一组生物标志物，这些生物标志物单独具有较小的折叠变化，但结合起来可以在体液蛋白质组学中捕获足够的信息，以解决混杂因素并准确诊断疾病状态。体液蛋白质组是多维的，受遗传学、性别、年龄、生活方式、既往疾病或治疗等因素的影响，生物标志物panel本质上更适合解决这种复杂性。

多路参考通道

三、数据分析方法

a) 大队列协同与矩形策略：

矩形策略利用大队列来更好地发现真正的生物标志物。检测区分病理病例和对照组的生物标志物面临着由混杂因素引入的变异性或偏差带来的挑战。在小队列中，病例和对照组之间的明显蛋白质组差异可能由随机混杂变异性主导。在大型队列中，这种随机性被大量稀释，导致感兴趣的真实效应和生物标志物候选物占主导地位，在进一步的独立队列中具有更好的验证前景。

大队列协同与矩形策略

b) 研究模拟现实的集体和分析：

研究集体需要与所研究的疾病和预期应用相匹配。例如，有些疾病是作为一系列或连续的表型出现的，或逐渐表现出来的，而对照者可能有不同程度的患病风险，甚至受某种疾病的影响。这可能需要纵向队列或比较多个条件，而不是依赖于病例和对照的二元分类。此外，复杂的场景可能只能通过大规模研究集体支持的基于人群的理解来解决。大的队列可以研究具有挑战性的场景。这些包括小效应量、用于鉴别诊断或结果分析的多种条件的比较、纵向变化、用于筛选应用的非常高的测试准确性的验证，或在群体水平上理解表型。

大队列可研究场景

四、未来展望

体液蛋白质组学的许多挑战现在已经被克服，许多研究已经在独立的队列中得到了验证。生物标志物虽仍集中在高丰度范围内，但也表明随着技术的进步正在将可检测的体液蛋白质组的边界推向较低丰度范围，还有更多的生物标志物等待发现。曾经的挑战已变为财富，基于质谱的体液蛋白质组学已做好准备走向未来。

参考文献：

【1】Jakob M. Bader, Vincent Albrecht, Matthias Mann,MS-Based Proteomics of Body Fluids: The End of the Beginning,Molecular & Cellular Proteomics,Volume 22, Issue 7,2023,100577,ISSN 1535-9476, https://doi.org/10.1016/j.mcpro.2023.100577.

【2】J.M. Bader, P.E. Geyer, J.B. Müller, M.T. Strauss, M. Koch, F. Leypoldt, et al.Proteome profiling in cerebrospinal fluid reveals novel biomarkers of Alzheimer’s disease. Mol. Syst. Biol., 16 (2020), Article e9356.

【3】S. Hartwig, A. Czibere, J. Kotzka, W. Paßlack, R. Haas, J. Eckel, et al. Combinatorial hexapeptide ligand libraries (ProteoMiner): an innovative fractionation tool for differential quantitative clinical proteomics Arch. Physiol. Biochem., 115 (2009), pp. 155-160.

【4】L. Dayon, O. Cominetti, M. Affolter Proteomics of human biological fluids for biomarker discoveries: technical advances and recent applications .Expert Rev. Proteomics, 19 (2022), pp. 131-151 .

（文章来源：mp.weixin.qq.com/s/BbOCG2bs4I9qY1SzW8_cQw）